恒遠技術員為客戶解說ELISA不顯色原因

據客戶鄭老師提出的技術問題，上海恒遠公司技術員解說出ELISA不顯示的原因，我公司將重點內容整理出，在這里分享給各位，希望能夠給您的ELISA試劑盒實驗帶來幫助。

問題描述：以前是空白值太高，現在是所有的孔讀值都在0.09左右(空白孔也是)，哪里都檢查了，不知道是哪一步錯了。我的步驟是這樣的： 采用間接ELISA檢測抗血清效價。 用pH 9.6, 0.15 mol.L-1的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為8、2、0.5μg·mL -1 , 包被酶標板, 每孔100μL, 4℃包被過夜。次日每孔加入100μL 7%的山羊血清封閉液, 37℃封閉2h后, 用PBST洗滌3次。然后每孔加入400、800、1600、3200倍稀釋的羊抗血清100μL, 空白對照為兔抗血清稀釋液( BSA+PBS)，37℃孵育1 h后，同上洗滌3次。再次每孔加入100μL HRP標記的羊抗人IgG, 37℃孵育30 min后, 同上洗滌3次。接下來每孔加入100μL TMB顯色液, 37℃避光反應15 min后, 每孔再加入50μL終止液。最后，在酶標儀上測450 nm下的OD值。 不顯色(幾乎沒有藍色），后來用以前的ELISA試劑盒剩下的TMB，就顯色，TMB是新的，沒有問題，而且我用二抗加TMB后反應藍色，這應該是TMB和二抗都沒有問題吧？真不知道是哪里的原因了。

恒遠技術：請問您包被的重組蛋白是人源的？如果是人源的，那么您加的二抗是羊抗人，這樣測得的結果是不是不準確。間接法的二抗似乎應該和您的待測抗體結合。所以是不是應該選擇HRP標記的X抗羊抗體？

鄭老師：我不太理解您的意思，我做的包被的重組蛋白是人源的，待測抗體是lgG類的，二抗是抗lgG的HRP標記的抗體。

恒遠技術：您做的是間接法，包被抗原是人源，待測抗體是羊源抗人，那么酶標二抗應該與待測抗體結合而不是包被的抗原，所以應該是其他種屬抗羊抗體。因為看了您的敘述我感覺您的抗體種屬可能有問題。本底太高是不是封閉液有問題。換BSA或者脫脂奶粉可以試一下。

鄭老師：嗯，我前面可能敘述有誤，待測抗體是人血清中的抗體。謝謝您的解答!

恒遠技術：不用謝！

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